• 1 Je raconte l’histoire de la découverte des archées par Carl Woese dans mes ouvrages « Microbes de l (...)
• 2 Cette division se basait principalement sur la présence (eucaryote) ou l’absence (procaryote) d’un (...)
• 3 Proceedings of the National Academy of Science.

1Mon histoire d’amour avec les archées a commencé en 1982 avec la lecture de la revue de Carl Woese, publiée dans Scientific American, dans laquelle il décrivait en détail les recherches qui l’avaient conduit à mettre en évidence une différence fondamentale au niveau moléculaire entre les bactéries « classiques » et un groupe de bactéries atypiques qu’il avait baptisé archéobactéries (1)1 (Figure 1). Selon lui, le monde vivant ne devait plus être divisé en deux grandes catégories, eucaryotes et procaryotes2, mais en trois : eucaryotes, eubactéries et archéobactéries. Je n’avais pas lu l’article princeps à sa sortie en 1977 dans PNAS3 (2) car, comme la plupart des biochimistes et biologistes moléculaires, je ne suivais pas à l’époque la littérature sur l’évolution des microorganismes. Je n’ai cessé depuis de conseiller à mes étudiants et à mes collègues de continuer à lire les revues de vulgarisation, afin de ne pas rester confiné dans son domaine d’expertise.

• 4 La réplication correspond à la duplication de la double-hélice d’ADN pour former deux double-hélice (...)
• 5 Adenosine triphosphate, son hydrolyse en adénosine diphosphate (ADP) libère l’énergie nécessaire au (...)

3J’étais à l’époque jeune assistant titulaire à l’Université Paris VII et je travaillais sur la réplication de l’ADN4 chez Escherichia coli à l’Institut de biologie moléculaire du CNRS sur le campus de Jussieu. J’avais découvert ce sujet, en plein essor au début des années 1970, grâce au cours de biologie moléculaire donné par François Gros. J’avais rejoint pour ma thèse Masamichi Kohiyama, qui avait hérité de ce sujet suite à son passage dans le laboratoire de François Jacob, lequel avait proposé en 1963, le modèle du réplicon. Je travaillais sur le rôle de l’ATP5 dans la réplication de l’ADN en utilisant un modèle de réplication in vitro. Je m’étais plus particulièrement intéressé à l’ADN gyrase. Cette enzyme fascinante peut introduire des super-hélices négatives dans l’ADN, grâce à l’énergie de l’ATP (Figures 2 et 3). Dans une super-hélice, la double hélice bien connue s’enroule sur elle-même, en formant des supertours. Les super-hélices sont dites négatives si elles s’enroulent dans le sens contraire des tours formés par l’enroulement des deux brins de l’ADN dans la double hélice. Ce « surenroulement » inversé peut provoquer localement l’ouverture des deux brins de l’ADN (Figure 3), ce qui va faciliter toute une série de processus, tel que la réplication de l’ADN ou la lecture de certains gènes. J’avais montré que des inhibiteurs de la gyrase, l’acide nalidixique et la novobiocine, inhibaient la réplication de l’ADN in vitro. En 1980, j’avais proposé le premier modèle qui supposait que cette enzyme introduise des coupures double-brins dans l’ADN, et non simple-brin comme on le pensait jusque-là. Cette caractéristique allait par la suite définir les ADN topoisomérases de type II (Topo II) (encadré 1). Ces enzymes sont présentes chez tous les organismes à ADN car elles sont indispensables pour éliminer les super-hélices positives qui se forment pendant la réplication pour compenser l’ouverture des deux brins et pour séparer les chromosomes entrelacés à la fin des divisions cellulaires. Nous verrons toutefois que toutes n’ont pas l’activité gyrase présente chez les bactéries.

• 6 Malheureusement, aucun de ces chercheurs n’a obtenu le prix Nobel, alors que leurs découvertes ont (...)

4J’étais donc fasciné par tout ce qui tournait autour de la topologie de l’ADN. Malheureusement, j’étais en compétition avec des équipes américaines toutes plus performantes les unes que les autres, celles de Jim Wang, le découvreur des ADN topoisomérases en 1970, de Martin Gellert, qui avait découvert la gyrase en 1976, ou encore de Nick Cozzarelli, qui allait proposer en 1980 la distinction entre Topo de type I (Topo I) et de type II (Topo II) (encadré 1)6. Je ne pouvais pas jouer avec succès dans la même cour qu’eux, vu les faibles moyens dont nous disposions à Paris. Nous étions de plus isolés sur la scène nationale, les biochimistes de pointe en France s’étant presque tous focalisés sur l’ARN et la traduction. A défaut de pétrole, il fallait des idées ! Travailler sur les archéobactéries fut pour moi la bonne pioche. Je décidai d’étudier leurs ADN polymérases et topoisomérases. J’espérais pouvoir disposer de quelques années d’avance sur les chercheurs américains avant que ces derniers ne découvrent à leur tour l’intérêt des archées. Je me trompais, aucun de ceux cités plus haut ne s’est jamais intéressé aux archées, restant tous attachés aux organismes modèles bactériens ou eucaryotes. Il a fallu plus de vingt ans pour que de jeunes chercheurs aux USA ou en Grande-Bretagne se rendent compte de l’intérêt de la biologie moléculaire des archées et montent des équipes performantes sur le sujet à partir des années 2000.

• 7 Ce sujet est abordé dans le deuxième article de cette série.

6Le biochimiste allemand Wolfram Zillig (Figure 1) avait déjà montré à l’époque que les ARN polymérases des archées étaient beaucoup plus proches de celles des eucaryotes que de celles des bactéries. La liste des caractères eucaryotes des archéobactéries allait rapidement s’allonger, conduisant Woese à abandonner en 1990 ce terme pour le remplacer pour celui « d’archée » (4). Il n’était pas question pour lui que la communauté scientifique continue de confondre ses archées avec de quelconques bactéries atypiques. Les relations évolutives précises entre archées et eucaryotes restent aujourd’hui un sujet brûlant d’actualité parmi les évolutionnistes7.

• 8 Cette valeur est proche de la saturation.
• 9 Ces pâtes sont obtenues en centrifugeant à grande vitesse des milieux culture contenant de grandes (...)

7Si les archées halophiles se prêtaient bien aux études physiologiques, l’adaptation de leurs protéines aux concentrations de sel extraordinairement élevées de leur cytoplasme, 3-4 molaires de chlorure de potassium8, rendait l’approche biochimique très aléatoire chez ces microorganismes. Par contre, les protéines thermostables des archées thermoacidophiles du genre Sulfolobus, pouvaient faire rêver un biochimiste habitué à purifier les protéines fragiles des bactéries qui vivent à des températures beaucoup plus basses. Je décidai donc de rechercher les ADN polymérases et topoisomérases de cette archée qui vit de façon optimale à des températures autour de 75°C, à des pH acides compris entre 2 et 3. J’écrivis à W. Zillig qui m’encouragea et m’envoya un échantillon de Sulfolobus acidocaldarius. Je réussis à produire de grande quantité de pâte de cette archée thermoacidophile grâce au centre de fermentation du CNRS à Gif-sur-Yvette9 et à détecter les activités que je recherchais. Il fallait ensuite isoler les protéines impliquées et les caractériser.

• 10 Le contrôle du surenroulement de l’ADN par la gyrase, une enzyme ATP-dépendant, permet aux bactérie (...)

9En 1983, j’avais obtenu le feu vert de M. Kohiyama pour étudier les ADN polymérases des archées, mais pas pour leurs ADN topoisomérases ! Pour passer outre, j’avais démarré une collaboration avec Michel Duguet, professeur à Paris VI, dont le laboratoire était situé boulevard Raspail à Paris. Je travaillais donc dans la journée à Jussieu et le soir à Raspail avec Gilles Mirambeau, un doctorant de M. Duguet. A l’époque, les équipes américaines venaient de montrer que, contrairement à celles de bactéries, les Topo II des eucaryotes n’avaient pas d’activité gyrase, elles ne pouvaient que relâcher un ADN surenroulé. Vu l’intérêt de l’activité gyrase pour la physiologie cellulaire10, il semblait donc que sur ce point, nous – les eucaryotes – étions inférieurs aux bactéries, ce qui allait tout à fait à l’encontre des idées reçues. Je me posais donc une question simple : la Topo II des archées, des procaryotes, avait-elle une activité gyrase, comme chez les bactéries, ou était-elle dépourvue de cette activité, comme chez les eucaryotes ? Ce que je n’avais pas prévu, c’était l’existence chez les archées d’une activité inverse de celle de la gyrase, une « reverse gyrase », une ADN topoisomérase qui introduit dans l’ADN des supertours, non pas négatifs, mais positifs (Figure 3).

• 11 Les hélicases peuvent séparer les deux brins de la double-hélice, mais ne peuvent pas changer le no (...)

10Pour la première publication sur cette enzyme, nous avons été devancés par un chercheur japonais et une technicienne, qui, cependant avaient commis une erreur majeure dans leur première publication en 1984. Ils décrivaient en effet dans la revue Nature la reverse gyrase comme une Topo II. Cela semblait logique car elle avait besoin de l’énergie de l’ATP pour introduire des supertours positifs dans l’ADN et, jusque-là, toutes les ADN topoisomérases ATP-dépendantes connues étaient des Topo II. Or, dès l’année suivante, nous avons pu montrer avec Marc Nadal (doctorant de M. Duguet) que la reverse gyrase est une Topo I ATP dépendante, la première du genre et la seule connue jusqu’à ce jour (6). Le clonage du gène de la reverse gyrase par un troisième étudiant de M. Duguet, Fabrice Confalonieri, allait montrer que cette enzyme est en fait une protéine complexe, formée par la fusion d’un domaine Topo I et d’un domaine hélicase11, ce qui explique sa dépendance vis-à-vis de l’ATP (7) (Figure 5). Marc Nadal et son équipe poursuivent actuellement l’étude mécanistique de la reverse gyrase à l’École normale supérieure de Paris. L’analyse par la technique des molécules uniques leur a permis récemment de décortiquer le mécanisme qui aboutit à l’introduction d’un supertour positif dans l’ADN par cycle réactionnel (8).

• 12 Ceci explique pourquoi il n’existe pas de corrélation entre le pourcentage en base GC du chromosome (...)

11Quel est le rôle de la reverse gyrase in vivo ? J’ai pu m’attaquer à cette question après avoir installé en 1988 ma propre équipe de recherche intitulée « Biologie moléculaire du gène chez les Extrêmophiles » (BMGE) à l’Institut de génétique et microbiologie à Orsay (une unité mixte CNRS, Université Paris-Sud). L’introduction de supertours positifs correspond à une augmentation du nombre de liens topologiques entre les deux brins de la double-hélice. Nous avions montré avec M. Nadal que l’ADN circulaire d’un virus d’archée, le virus SSV1, que j’avais récupéré à Munich chez W. Zillig, était surenroulé positivement (9). J’avais ensuite rendu visite à Karl Stetter à Regensburg, qui avait découvert avec W. Zillig les premières archées mais aussi les bactéries hyperthermophiles, c’est-à-dire dont les températures optimales de croissance sont supérieures à 80°C. Il possédait les seuls fermenteurs au monde capables de produire en grande quantité ces bactéries et m’avait fourni des quantités importantes de « pâte » de ces organismes. Nous avons donc pu montrer avec Claire Bouthier de la Tour (équipe de M. Duguet), que la reverse gyrase était présente, non seulement chez les archées, mais également chez les bactéries hyperthermophiles (10). Il semblait alors évident que cette enzyme devait introduire in vivo chez les organismes vivants à haute température un surenroulement positif permettant de stabiliser l’ADN. A notre grande surprise, nous avons montré que ce n’est pas le cas, car certaines archées et bactéries hyperthermophiles ont un ADN surenroulé négativement (11). Elles possèdent à la fois la gyrase et la reverse gyrase et c’est la gyrase qui gagne ! De plus, dans l’équipe, Evelyne Marguet a pu montrer qu’un ADN double-brin circulaire fermé, qu’il soit surenroulé positivement ou négativement, reste stable in vitro au moins jusqu’à 107°C (12)12.

• 13 http://www-archbac.u-psud.fr/Meetings/LesTreilles/Treilles_frm.html56

13Dans sa revue parue dans Scientific American, Woese avançait l’idée selon laquelle la biologie comparée des trois domaines devait aider à reconstituer le dernier ancêtre commun à tous les organismes cellulaires actuels (archées, bactéries et eucaryotes). Cette perspective m’avait fasciné. En 1996, j’avais organisé à la fondation des Treilles en Provence un colloque pour discuter de ce problème. C’est au cours de ce colloque que cet ancêtre fut baptisé LUCA pour Last Universal Common Ancestor13. Il y avait débat concernant la nature de LUCA. Vivait-il dans des biotopes chaud ou froid ? L’étude de la reverse gyrase pouvait-elle permettre d’apporter quelques éléments dans le débat ?

• 14 Vu la fragilité de l’ARN à haute température, l’hypothèse d’un lien direct entre une origine chaude (...)

15Cette conclusion va à l’encontre d’une idée largement répandue selon laquelle les hyperthermophiles seraient des reliques des premières formes de vie apparues sur la planète. J’ai toujours pensé qu’elles étaient plutôt des merveilles d’adaptation, la reverse gyrase en est un bon exemple qui est née de la fusion de deux protéines déjà élaborées, une Topo I et une hélicase. Si l’activité de la reverse gyrase a bien été toujours essentielle pour les hyperthermophiles, les organismes qui ont vécu avant cet événement de fusion ne pouvaient donc sans doute pas vivre à très haute température (Figure 5). Cette conclusion empêche d’imaginer un lien direct entre une origine de la vie brûlante et LUCA (15)14. Je n’ai jamais réussi à convaincre certains de mes collègues et amis, en particulier K. Stetter, de cette logique. Pour eux, et pour de nombreux journalistes scientifiques, l’hypothèse d’une origine chaude de la vie est trop excitante pour ne pas être vraie !

• 15 ADN topoisomérase VI dans la littérature scientifique ce qui crée une certaine confusion entre la n (...)

16La découverte en 1985 de la reverse gyrase (une Topo I) avait laissé en suspens la question qui me préoccupait : les Topo II des archées possédaient-elles une activité gyrase ? Nous pensions que oui, car nous avions montré que les archées halophiles et certaines archées méthanogènes étaient sensibles aux inhibiteurs de la gyrase bactérienne (16). Mais pour répondre vraiment à la question, il fallait isoler une Topo II d’archée. En 1994, une post-doctorante, Agnès Bergerat, et une ingénieure CNRS, Danielle Gadelle, ont réussi à isoler la Topo II de Sulfolobus shibatae (Figure 6). Cette enzyme n’avait pas d’activité gyrase, ce qui semblait a priori la rapprocher de l’enzyme eucaryote. Par contre, elle était composée de deux sous-unités, A et B, comme la gyrase bactérienne. Le clonage du gène codant pour cette enzyme, en utilisant les techniques laborieuses de l’époque, allait nous apporter une surprise de taille (17). Au niveau de sa séquence, la Topo II de S. shibatae ne ressemblait ni à la gyrase bactérienne, ni à la Topo II des eucaryotes. Elle correspondait à une nouvelle famille que nous avons appelé Topo IIB (les Topo II déjà connues devenant les Topo IIA). Nous l’avons baptisé ADN topoisomérase VI (Topo VI15) pour tenir compte de la nomenclature historique des ADN topoisomérases déjà connues à l’époque (Tableau 1).

• 16 Il est probable que l’ancêtre commun des archées était un hyperthermophile.

17Nous savons aujourd’hui, grâce à la génomique comparée, que presque toutes les archées possèdent la Topo VI qui devait être présente chez leur dernier ancêtre commun, LACA (the Last Archaeal Common Ancestor) mais qu’un certain nombre d’entre elles ont acquis en plus la gyrase par transfert de gènes venant des bactéries (18). Ceci explique pourquoi certaines archées hyperthermophiles possèdent à la fois la gyrase et la reverse gyrase. La gyrase est toutefois surtout présente chez les archées qui vivent à basse température. On pense que l’acquisition de la gyrase bactérienne par ces archées a pu les aider à s’adapter au froid16 et que, à l’inverse, l’acquisition de la reverse gyrase des archées a pu aider certaines bactéries à s’adapter à des milieux chauds.

• 17 Ces structures ont été résolues par la technique de la diffraction aux rayons X.
• 18 La Topo 8 est codée par des gènes principalement présents chez des plasmides conjugatifs bactériens (...)

21Nous avons entrepris de résoudre la structure de la Topo VI en collaborant avec l’équipe d’Herman Van Tilbergh à Orsay. Nous avons obtenu cette structure sous la forme « ouverte » qui lui permet de fixer deux hélices d’ADN (22), l’équipe de J. Berger aux USA ayant publié quelques mois auparavant celle de la forme « fermée »17. En superposant ces deux structures, on peut comprendre comment la Topo 6 peut faire passer deux double-hélices d’ADN l’une au travers de l’autre (Figure 6). Par la suite, nous avons pu poursuivre nos travaux sur les Topo IIB grâce à la persévérance de D. Gadelle qui allait découvrir en 2013 un nouveau membre de cette famille, la Topo 8 (23), la première ADN topoisomérase plasmidique (Tableau I)18.

• 19 La Topo IB n’était présente chez aucune des archées connues avant 2008. Nous l’avons identifié dans (...)
• 20 Cette archée, proche des Thaumarchées, est officiellement classée dans le phylum des Aigarchaeota.

22Ces dernières années, les archées nous ont encore permis de faire une avancée significative dans la compréhension des ADN topoisomérases eucaryotes. Nous avons en effet découvert que certaines archées19 possèdent une Topo I de la famille IB très proche de celle présente chez les eucaryotes (24). Cette enzyme a été très étudiée chez l’homme car elle est la cible d’une drogue anticancéreuse importante, la camptothécine. La structure de la Topo IB humaine n’a été résolue qu’en présence d’ADN. Un chercheur post-doctorant travaillant dans notre équipe à Orsay, Tomio Takahashi, a réussi à cristalliser la Topo IB d’une archée thermophile, Caldiarchaeum subterraneum20, en absence d’ADN (25). L’enzyme des archées et celle de l’homme sont si proches qu’il lui a été possible, en comparant les deux structures, avec et sans ADN, de déterminer les changements de conformation induits par la fixation de l’ADN et ainsi de reconstituer le cycle enzymatique complet. Contrairement à l’enzyme humaine, la Topo IB des archées, pourtant très semblable, est résistante à la camptothécine. Sa comparaison avec celle de l’homme permettra peut-être de mieux comprendre les raisons de cette différence et d’acquérir de nouvelles connaissances sur le mode d’action de cette drogue anticancéreuse.

• 21 Nos analyses phylogénétiques ont montré que l’ADN gyrase a été transférée d’une bactérie à l’ancêtr (...)

23L’étude de la topologie de l’ADN chez les archées se poursuit actuellement dans l’équipe « Biologie cellulaire des archées » (BCA) à l’Institut de biologie intégrative de la cellule (I2BC) de Gif-sur-Yvette. Cette équipe est dirigée par Jacques Oberto, directeur de recherche au CNRS, qui avait rejoint BMGE en 2005 pour travailler avec moi sur les archées. Les travaux sur la topologie de l’ADN sont pilotés par Tamara Basta, maitre de conférence à l’Université Paris-Saclay. Son doctorant, Paul Vilain, vient de reproduire, grâce aux outils génétiques désormais disponibles, le transfert génétique qui a permis l’introduction de la gyrase chez certaines archées, il y a 2 ou 3 milliards d’années (26)21. Il a en effet réussi à transférer la gyrase d’une bactérie hyperthermophile, Thermotoga maritima, chez l’archée hyperthermophile T. kodakaraensis, qui ne la possédait pas (27). La souche transformée est viable et son ADN devient surenroulé négativement. Comment cette archée recombinante fait-elle pour adapter toute sa biologie à un tel changement de conformation de son ADN ? L’étude de cette souche est en cours afin de répondre à cette question.

• 22 Selon de nombreux auteurs, les Asgard seraient les ancêtres directs des eucaryotes, pour d’autre, y (...)

24Vu l’importance des ADN topoisomérases dans le monde cellulaire, j’avais fait très tôt le pari qu’étudier ces enzymes chez les archées devrait nous permettre d’en apprendre plus sur l’histoire de la vie sur notre planète. Au vu des résultats obtenus avec la reverse gyrase et la Topo VI, je considère que ce pari a été plutôt réussi. La découverte et l’étude de la reverse gyrase nous ont appris que LUCA n’était pas un hyperthermophile et la découverte chez les archées d’une Topo II qui n’est pas homologue à celles des bactéries soulève la possibilité d’un LUCA sans ADN, une hypothèse sur laquelle je reviendrais dans un second article. Il reste toutefois encore de nombreux points d’interrogation, nous aimerions en particulier comprendre quel est le véritable rôle de la reverse gyrase. Il y a quelques années, un chercheur japonais, Hiroki Higashibata, a passé un an à Orsay pour isoler des mutants de cette enzyme et tenter de répondre à la question. Ces travaux, qui se poursuivent dans l’équipe BCA et au Japon, devraient nous permettre de résoudre cette énigme. Enfin, en analysant les génomes d’un nouveau groupe d’archée récemment identifié, le super phylum des Asgards, j’ai détecté une Topo VI atypique qui ressemble beaucoup à celle des plantes. Ces archées possèdent certains caractères eucaryotes qui leur sont propres et dont l’origine reste mystérieuse22. Je suis donc persuadé que les ADN topoisomérases des archées n’ont pas fini de nous surprendre.